Sanger法测序

模板制备
制备高质量的测序模板是DNA测序成功的关键参数之一。所有类型的测序纯化模板必须进行定量，并根据测序指南使用适量的DNA模板进行测序反应。在众多的测序模板中，PCR产物模板和质粒模板是最常用的，需要精心准备才能获得最佳的测序质量和结果。对于PCR产物模板，应使用高等级纯化试剂对PCR产物进行纯化，从而去除PCR产物中的引物，非特异性PCR产物，dNTPs和DNA聚合酶等其他杂质，这些杂质可能通过改变测序反应条件或干扰测序反应而影响测序反应质量和结果。虽然PCR产物纯化方法很多，但最常用的方法是离心柱纯化和磁珠纯化。其中，离心柱纯化效果会更好，但是成本更高，时间也更长。

测序反应

测序循环反应利用线性扩增，在一个反应中利用一个引物和一个模板产生末端标记的延伸产物， 但是由于荧光双脱氧核苷酸(ddNTPs)的掺入导致测序循环反应链终止，从而产生了一组只有一个单核苷酸差异的延伸产物。在常规的测序循环反应试剂盒中，dITP被用来代替dGTP以减少遗传分析仪的峰值压缩。然而，对于高G-模板(GT或GC)，常规试剂盒中的dITP被dGTP取代以优化测序性能和结果。

测序产物纯化

循环测序反应之后必须对测序反应产物进行纯化，以去除其中影响毛细管电泳的杂质，特别是未参与反应的ddNTP荧光染料。如果不能去除这些杂质，就会导致信号衰减，干扰峰值以及测序读长。测序产物纯化有多种不同的方法，每种方法都有其优缺点。在树脂纯化方法中，杂质与特殊树脂结合并被清除；在磁珠纯化方法中，延伸产品结合磁珠，杂质被分离；酒精沉淀法也是常用的测序产物纯化方法，价格便宜，但是相当耗费时间。

毛细管电泳 

在检测荧光信号的遗传分析仪的毛细管内填充分离胶和纯化后的线性末端标记荧光延伸产物，这些荧光信号通过遗传分析软件转换成DNA序列信号。根据使用的纯化方法或产品的不同，样品可以直接毛细管电泳，或装入前需要加入ddH2O或甲酰胺再进行毛细管电泳。用酒精沉淀纯化的测序产物需要在高度去离子化甲酰胺中溶解，以获得最佳的信号强度和稳定性。用磁珠方法纯化的测序产物，直接添加ddH2O溶解然后进行毛细管电泳。而用XT树脂纯化方法的测序产物，仅需震荡离心，即可直接毛细管电泳。

毛细管清洗与维护 

基因测序仪被长期使用后，需要清洗和维护毛细管，以溶解和清除毛细管内积聚的污垢，这有助于在毛细管电泳时提升和恢复正常的分离性能。如果没有适当的清洗和维护，毛细管的寿命会很短，更换成本也会很昂贵。毛细管再生清洗试剂盒用于遗传分析仪的毛细管日常清洗和维护，以去除数上千次仪器运行后积聚在毛细管内的污染物，重新让毛细管恢复到最佳性能。